Folin-酚試劑法（Lowry法）測定蛋白質(zhì)含量

一、實(shí)驗(yàn)原理

  蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵（—CO—NH）,因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與CU2+  形成絡(luò)合物。Folin-酚試劑反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)Folin試劑（磷鉬酸-鎢酸試劑）,蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。

   本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、靈敏度高、較此外吸收法靈敏10~20倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應(yīng)約在15min內(nèi)有zui大顯色，并至少可穩(wěn)定幾小時(shí)。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的基團(tuán)，Tris.HCL緩沖劑以及蔗糖、硫酸銨、巰基化合物，酚類及檸檬酸，均對此反應(yīng)有干擾作用。在測試時(shí)應(yīng)排隊(duì)干擾因素或做空白實(shí)驗(yàn)消除。含硫酸銨的溶液只需加濃Na2CO3-NaOH溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后色淺，則必須將Na2CO3-NaOH溶液的濃度提高1~2倍。

   本法可測定范圍是25~250µg蛋白質(zhì)。          

二、實(shí)驗(yàn)用品

（一）器材

 （1）722型分光光度計(jì)。

     （2）恒溫水浴鍋。

     （3）試管及試管架。

     （4）0.5ml，1ml及5ml移液管

• 試劑

   （1）試劑甲。

   （A）4%Na2CO3溶液；

   （B）0.2mol/LNaOH溶液；

   （C）2%酒石酸鉀鈉溶液（或酒石酸鉀、酒石酸鈉）；

   （D）1% CuSO4.5H2O溶液；

     臨用前將（A）:（B）:（C）:（D）=50:50:1:1(體積比)混合，此混合液即為試劑甲?；旌虾蟮娜芤?d內(nèi)有效。

（2） Folin-酚試劑(試劑乙)：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉（Na2WO4.2H2O），25g鉬酸鈉（（Na2MoO4.2H2O），及700ml蒸餾水，50ml 85%磷酸，100ml濃鹽酸充分混合，燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出，接上回流冷凝管以文火回流10h?；亓鹘Y(jié)束后，加入150g硫酸鋰（LiSO4）,50m重蒸水及數(shù)滴液溴，開口繼續(xù)沸騰15min，以除去多余的溴。冷卻后溶液呈金黃色（如果仍呈綠色，須再重復(fù)滴加溴水的步驟），定容至1L，過濾，濾液置棕色瓶中保存，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸數(shù)分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定酸度，以酚酞為指示劑。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋至相當(dāng)于1mol/L酸度使用，即為Folin-酚試劑。

（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：可用結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，再根據(jù)其純度配制成500µg蛋白/ml溶液。

（三）材料

     血清使用前稀釋100倍或約含20~250µg蛋白/ml溶液。

三、實(shí)驗(yàn)程序

    一、操作方法

 1.蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 

   取14支試管，分兩組按表9-1平行操作。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以OD650值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.樣品溶液蛋白質(zhì)濃度測定

  取6支試管，分兩組，按表9-2平行操作。

3、計(jì)算